服务介绍
荧光定量PCR应用广泛 可以对各种基因的表达进行定量分析,如:同一基因在不同组织中的表达差异、同一基因在不同药物处理后的表达差异、转基因食品的检测。过去最常用的高通量筛选基因表达差异的技术是 cDNA 芯片和差异显示,但这两种技术的缺点是只能定性而非完整意义上的定量分析。实时 PCR 技术和高通道实时 PCR 仪的出现,无疑为这种检测提供了极大的方便。

可以进行点突变分析和等位基因分析,用不同的荧光报告基团标记 Taqman 探针,然后分别与野生型和突变型杂交,如果一种荧光信号明显强于另一种荧光信号,则表明它是纯合子;如果两种荧光信号都明显增强,则表明它是杂合子。另外分子信标( Molecular Beacon )就是专门为这种技术设计的探针。

可以进行单核苷酸多态性的分析,检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义,因分子信标结构的巧妙性,一旦 SNP 的序列信息是已知的,采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

可以进行 DNA 甲基化检测, DNA 甲基化同人类的许多疾病有关,特别是癌症, Laird 报道了一种称作 Methylight 的技术,在扩增之前先处理 DNA ,使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受影响,用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ,这种方法不仅方便而且灵敏度更高。

对传染性疾病进行定量定性分析,这在我国应用比较广泛,大家比较熟悉。许多生产临床 PCR 试剂的厂商已经陆续推出了一系列的诊断试剂,如:肝炎系列、性病系列、肿瘤系列等等。

FRET技术
  两条直线型寡核苷酸探针,其中一条的 3 ‘端标记荧光激发基团,另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团,在无靶序列的情况下,两条探针分开,无法进行能量的传递,这样荧光仪不能检测到荧光信号;而当有靶序列时,即在 PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合,使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递,这样荧光仪就可以检测到荧光信号,荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

 

SYBR Green 技术
        在PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光染料或荧光探针对扩增产物进行标记,采用实时监测法对未知模板进行定量分析。
荧光染料SYBR Green I只和双链DNA结合,不与单链DNA、RNA结合。与DNA双链结合后发出很强的荧光信号,游离的SYBR Green I仅产生非常弱的荧光信号。

TaqMan探针法
        是指pcr扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针,该探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭,仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长,因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)就会将切割探针,释放5′端报告基团游离于反应体系中,远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽,5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
 


客户须知
1.进行mRNA表达量分析时,如果提供的材料为Total RNA,请寄送足量的并且保证纯度的Total RNA(浓度在200 ng/μl以上,体积在20 μl以上,纯度A260/280在1.8-2.0间)。如果目的基因表达量低时,应尽量提供更高浓度的Total RNA。
2.如果提供的材料为细胞或组织,DNA、RNA的提取费用另收。 同时应保证材料新鲜,动物细胞数为106以上,动物组织为100 mg以上。
3.目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、关键词),mRNA需说明具体剪接子及检测范围(公共区域或特异性区域)。
4.引物设计的区域范围(全序列、5′端序列、3′端序列)。
我们提供
1. 根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。
2. 提取 DNA/ RNA 。
3. Real Time PCR(荧光定量PCR),进行实验结果分析
4. 实验完成后,提供完整的实验报告(含软件分析结果)及引物等实验材料 。