细胞凋亡
       细胞凋亡是细胞根据自身程序结束其生命的主动死亡的过程,具有特征的形态和生化改变,是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。 细胞凋亡过程是一系列形态学变化,如细胞皱缩、骨架瓦解、核膜解体、染色质皱缩、DNA片段化、凋亡小体形成。

        
       细胞凋亡各事件具有时序性,即各事件按先后顺序依次发生,最终生成凋亡小体。人为将时间分为“凋亡启动期”、“凋亡早期”、“凋亡中期”、“凋亡晚期”。
            

       

    检测方法
  1.         1、钙离子事件

        早期钙离子信号在凋亡的早期初始阶段,参与caspase-3的激活和细胞色素c的释放。
        检测原理:高特异性荧光指示剂与Ca2+结合,反应细胞内Ca2+浓度的变化。
        检测方法:Fluo-3-Am作为高度特异性Ca2+荧光指示剂,进入细胞后代谢成Fluo-3留在细胞内,与细胞内游离钙结合后,其荧光强度是本身的40倍以上。细胞凋亡时,细胞的绿色荧光强度增加。

       

  1.        2、caspase事件

       检测原理:荧光标记的Caspase底物被凋亡细胞摄取并结合,而正常细胞不能结合该底物。因此洗涤后,凋亡细胞可检测到荧光,正常细胞则不能。
       检测方法:D2R [(aspartyl)2-rhodamine 110,二门冬氨酰-罗丹明110] 作为Caspase的通用底物,膜通透性高,且本身为非荧光物质而被Caspase剪切后,释放出Rhodamine110,发出绿色荧光。

       

  1.         3、线粒体事件

       检测原理:正常细胞线粒体处于高电位水平,发生凋亡时线粒体膜电位下降,电位的变化可以使染料荧光强度发生变化。
       检测方法:
        1)    JC- 1 (5,5’6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)
        正常细胞线粒体膜电位较高,JC- 1以聚合体的形式,激发后呈红橙色荧光。凋亡时膜电位降低,JC- 1以单体存在,激发呈绿色荧光。

        

  1.         2) Rhodamine 123 (罗丹明123, 阳离子荧光染料)
            正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,荧光强度减弱或消失。凋亡时,线粒体膜完整性破坏,线粒体膜通透性转运孔开放,Rho123 重新释放出线粒体,发出强黄绿色荧光。

        4、细胞膜事件

        1)   Annexin-V-FITC 
         检测原理:细胞凋亡时细胞膜结构发生重排,一些原本在莫内侧的磷脂酸丝氨酸暴露到膜外侧,被特异性探针Annexin-V-FITC标记,进而被检测。
        2)   PI 
         检测原理:凋亡中晚期的细胞和死细胞,核酸染料PI能透过细胞膜而使细胞核红染。
         检测方法:将 Annexin V 与 PI 匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来:PI 被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC 和 PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

        

  1.         5、细胞核事件

        1)   PI染色
        检测原理:细胞凋亡时,DNA断裂、降解,小分子DNA可以通过细胞膜逃逸到细胞外,另外凋亡小体也可以被带走一部分DNA,造成凋亡细胞的DNA含量呈现非倍体性的下降。            
        检测方法:DNA含量下降导致对DNA染料PI的着色能力下降,表现在二倍体 G0/1 峰前出现 “亚二倍体”峰,即凋亡峰,根据此峰可测出凋亡细胞百分率。

        

        2) TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)
        检测原理:凋亡时DNA裂解200bp的DNA碎片,碎片会暴露出多个3’-OH末端,利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT),催化外源性dUTP或Brd-UTP连接到DNA碎片的3-OH末端。
        检测方法:以荧光物质标记抗dUTP或BrdUTP单抗,检测dUTP或Brd-UTP的数量,间接得到3’-OH末端的数量,进而判断凋亡。

  1.         

应用
        细胞凋亡广泛应用于肿瘤防治、抗肿瘤药物研发与药物机制研究、过度凋亡行疾病如神经退行性疾病、移植排斥等,病毒感染等多领域研究。