北京汉藤生物医学物科技有限公司

一、ELISA技术简介
ELISA是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及可自动化操作等特点。它适合用于检测样品数量多,或者经mRNA表达谱芯片、蛋白芯片或蛋白质组学等实验找出差异蛋白后,进一步验证差异蛋白。
ELISA的原理是,抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。
1, 在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。,
2, 然后用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
3, 再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
4, 加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
5, 由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

二、ELISA实验概况
酶联免疫吸附剂测定可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体,②酶标记的抗原或抗体,③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。常用的方法有双抗体夹心法、间接法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、以及应用亲和素和生物素的ELISA。其中双抗夹心法是最常用的方法,步骤如下:
(1)将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(2)加受检标本,使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
(3)加酶标抗体,使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
(4)加底物,夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
ELISA实验过程

 

三、ELISA案例展示
ELISA检测抗人OPN蛋白抗体特异性
左图添加了人OPN蛋白N端(1-166aa),右图添加了人OPN蛋白C端(167-314aa)。不同抗体对人OPN蛋白的识别特异性如图所示,其中2C5,2H9,2F10和2E11识别N端,1F11识别C端。结果表面各个抗体对人OPN蛋白均有很好的识别特异性。
ELISA案例展示

  1. 四、客户提供

1、尽可能详细的背景资料。
2、实验样本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等,邮寄前请与我公司技术支持沟通确认。
3、检测试剂盒(或购买我公司的检测试剂盒)。

注意事项:
1、客户收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。
2、对收集后当天进行检测的标本,储存在4 ℃备用。
3、对因特殊原因需要周期收集的标本,需将标本及时分装后放在-20 ℃或-70 ℃条件下保存,并避免反复冻融。
4、标本2-8 ℃可保存48小时,-20 ℃可保存1个月。-70 ℃可保存6个月。
5、部分激素类标本需添加抑肽酶。
6、强烈推荐客户在取材前先与我公司销售技术人员沟通,前期的取材直接影响到您的实验结果。

五、我们提供
(1)根据实验具体需求,提供492或490nm、450nm、405nm、585nm等各种波长的ELISA检测数据;
(2)完整的实验报告单(包括实验步骤、仪器试剂等信息)。

  • ELISA应用范围:
  • 免疫酶染色各种细胞内成份的定位
  • 研究抗酶抗体的合成
  • 显现微量的免疫沉淀反应
  • 4、定量检测体液中抗原或抗体成份
  • ELISA技术特点:
  • 灵敏度高,(可达ng甚至pg水平)
  • 特异性好
  • 实验周期短;
  • 应用范围广
  • Elispot
  • 检测原理ELISPOT就其原理来说实在是很简单的,从本质上说和ELISA的原理是一样的:细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后, 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合,其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后,PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子,通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.

  • 与ELISA的区别
  • ELISPOT法源自ELISA,又突破传统ELISA法,是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白,它们最大的不同在于:
    1、ELISA通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。
    2、ELISPOT通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数,1个斑点代表1个活性细胞,从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。(某些研究不仅要测细胞因子生成量,还需检测分泌此细胞因子的细胞频率)
    3、由于是单细胞水平检测,ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏,能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该蛋白的细胞。
    4、捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗,在研究者以刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。

    elispot

     

     

     

     

     

     

     

     


     

  • 预包被ELISpot
  • 1. 特异性单抗包被在培养孔底部,通过非特异性蛋白溶液封闭多余空白位点
    2. 加入单个细胞悬液及刺激物培养,阳性细胞经活化分泌细胞因子,细胞因子就近被特异性包被抗体捕获;
    3. 移出细胞,板底留下细胞因子的“影像”
    4. 加入酶标记的检测抗体,检测抗体和“影像”——细胞因子结合,形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构
    5. 加入显色底物,在酶的催化分解下,生成不可溶的色素,沉淀在膜上,即形成斑点
    6. 斑点计数,结果分析。

    elispot

     

    • 疫苗研究开发
    • 干细胞功能分析
    • 自身免疫疾病的诊断、免疫治疗的监控和预后分析
    • 化合物和药物免疫学反应的筛选
    • 器官移植中排斥反应的预测
    • 细胞杂交瘤的筛选
    • 基因治疗中转染效率的检测
    1. Luciferase报告基因技术简介

    Luciferase报告基因检测服务,采用荧光素酶报告基因检测系统,以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性。该系统的检测原理是,荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence),然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。

    1. Luciferase报告基因实验概况

    (1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒,如psiCHECK等。
    (2) 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
    (3) 加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
    lucifrase流程图

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Luciferase报告基因服务流程
    1. PCR扩增靶基因的Promoter,或直接合成结合位点序列;
    2. 片段裁切或点突变设计靶基因的Promoter并以PCR扩增,或直接合成序列;
    3. 将上述不同DNA片段分别克隆至报告载体pGL4质粒;
    4. 将报告载体转染待检细胞;
    5. 多功能酶标仪检测报告基因的表达水平。

    1. 客户提供
    2. miRNA与靶基因的信息。
    3. 相应检测细胞株。

     

    我们提供
    1、克隆含有靶基因3’UTR或结合位点序列的报告质粒;
    2、检测结果与完整的实验报告。

     

     

    • Luciferase报告基因应用范围
    • 检测转录因子与目的基因启动子区DNA的相互作用
    • Luciferase报告基因技术特点
    • 采用Promega公司特有psiCHECK质粒
    • 所采用的Luciferase双荧光报告系统,可以获得宽泛的线性定量范围与极高的灵敏度
    • 采用瞬时转染技术,操作简便、快速,周期短,适用于绝大多数细胞类型金

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