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       细胞内的大多数活动都是pH值敏感的,包括细胞体积调节、囊泡运输、细胞极化、纤维收缩以及支架的建立。因此在研究细胞内蛋白转运、Ca2+等离子活动时需测定pH值。现实验中常采用非侵入性高通量方法,即采用流式细胞仪分析pH值敏感的荧光探针,细胞能够荷载上荧光染料或荧光蛋白,其荧光随着pH值的变化而变化。荧光素分子能够吸收一定波长的光子并跃迁入激发态,之后能量会以较长波长的光发散出来。根据计算得到细胞内pH值。

  1. 1, 荧光染料法

2',7'-二(羧乙基)-5(6)-羧基荧光黄(BCECF)和羧化半萘罗丹明类荧光探针(carboxy SNARF-1)是较为常用的。BCECF-AM 是一种亲脂性的非荧光分子,扩散进入细胞后,AM 基团水解生成荧光亲水性的BCECF分子,其荧光强度与细胞内的pH值变化相关的。利用流式细胞仪检测细胞内的荧光强度,根据校准曲线,得到细胞内的 pH 值。

  1. 2, 比率pHluorin法

pHluorin是荧光强度及光谱特征随pH值变化而改变的一类荧光蛋白。pHluorin的pKa值6.9,采用405nm和488nm激发光可以获得不同的荧光读数,根据比例测得细胞内PH值。

3. 红色荧光蛋白质pHRed在活体细胞内成像pH值的技术
pHRed的荧光寿命与pH值有关,根据这一特性采用440nm激发光或者在酸性环境下采用585nm激发光可以获得不同的荧光读数,根据两个激发光获得荧光读数的比例就可以读出细胞内PH值